编者按
乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，其包括多种不同的亚型，这些亚型在遗传、病理、临床治疗及预后上各不相同。传统的乳腺癌细胞系研究模型不能完全符合临床肿瘤发病的实际病理过程及其肿瘤异质性的特征。乳腺癌类器官（Organoids）是一种基于3D细胞培养（Three-dimensional cells culture）系统建立的模型，在保留患者肿瘤的分子表型和基因型变化的同时，再现原发肿瘤的异质性，因此被应用于肿瘤发病机制和抗肿瘤药物筛选的研究中。目前，乳腺癌的中医药研究大多以细胞系和人源性肿瘤异种移植为主，类器官的相关研究则相对缺乏。
今天我们一起来分享2024年6月一篇最新综述性文章——《乳腺癌类器官研究进展及中医药应用展望》，该综述简要介绍乳腺癌类器官培养体系的发展，以及其在生命科学研究中的应用，以期为中医药乳腺癌相关研究提供思路。
文章题目
乳腺癌类器官研究进展及中医药应用展望
杂志：《世界科学技术-中医药现代化》
发表时间：2024年6月4日
作者：高阳，刘胜，周细秋，史有阳等
单位：上海中医药大学附属龙华医院乳腺外科、上海中医药大学研究生院、上海中医药大学中医外科研究所等
01、研究背景
乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤，其发病率位居女性恶性肿瘤的第一位，严重威胁女性健康，乳腺癌的诊疗研究在分子生物学技术的帮助下，愈发细化、深入，塑造符合临床肿瘤发病及肿瘤异质性的模型对乳腺癌的综合治疗意义重大。
目前传统的乳腺癌相关的中医药研究主要依赖于乳腺癌细胞系和人源性肿瘤组织异种移植（Patient derived xenografts，PDX），乳腺癌细胞系构建简单、经济并可进行高通量药物筛选，被广泛应用于乳腺癌的基础研究和药物敏感性等研究，由于缺乏异质性，对癌症的研究往往过于片面，且经过上千代的传代培养、无数实验室的流通，细胞的基因组和行为都背离了当初的模样；PDX虽然能够保持较高的瘤内异质性和分子多样性，但其研究周期长、移植成功率低，无法进行高通量药物筛选。
乳腺癌类器官（Organoids）是指将手术中获得的新鲜乳腺肿瘤组织在体外利用3D培养技术形成的具有一定空间结构的三维细胞复合体，与传统的肿瘤模型相比，具有与来源乳腺癌组织相似的结构特征和功能特性，能够很好地保持原始肿瘤的异质性，对于中医药防治乳腺癌的基础研究及临床诊疗应用广阔。本文就乳腺癌类器官培养体系的发展，以及其在生命科学和中医药相关的应用作了综述。
02、乳腺癌类器官培养
1. 乳腺癌类器官研究历程
20世纪80年代，Roelofs等率先开发了三维培养物，1990年，证明了不同的细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）对小鼠乳腺细胞形态和功能的影响和重要性。Lee等描述了正常和恶性乳腺细胞的3D培养方案。有研究者培养出长期肠道类器官，并应用于结肠、肺、前列腺、胃、肝、胰腺以及乳腺等器官，同时形成了类器官生物样本库。Twigger等重建了乳腺的三维组织结构。2017年，Rosenbluth建立了人乳腺癌类器官生物库，标志着乳腺癌类器官培养体系的成熟。
要的价值。
2. 正常乳腺组织及乳腺癌类器官培养基组成成分
德国Linnemann等采用浮动胶原蛋白凝胶法建立乳腺类器官模型，乳腺组织通过切碎、消化、冷冻保存后进行过滤，以去除组织碎片和细胞聚集体。细胞以2D形式种植、培养，制成凝胶，正常乳腺类器官培养基（见表1）。选择Ⅰ型胶原作为底物，是因其构成了人体乳腺（Mammary gland，MG）细胞外基质的主要成分，并提供了可被用来模拟不同微环境的特性。此外，还观察到乳腺癌细胞系在自由漂浮的胶原凝胶中产生管状结构。
表1
Sachs等从BC术后患者身上获取肿瘤组织，结合机械与物理操作，分离出正常组织，获取BC细胞，然后将组织碎片消化、去除上清、静置、混匀成匀浆状；将培养的细胞与基质凝胶混合，放置成胶，乳腺癌类器官培养基组成（见表2）。同时，发现神经调节蛋白1是人表皮生长因子受体（Human epidermal growth factor receptor，HER）酪氨酸激酶-3和-4的配体，与乳腺发育和肿瘤发生有关，将其添加到BC类器官培养基中可以高效地生成BC类器官，并使其长期扩增20代。
表2
03、乳腺癌类器官的研究及应用
1. 研究肿瘤的发生机制
BRCA1的缺失导致乳腺肿瘤的发生，Wang等通过构建小鼠BRCA1乳腺癌模型培养乳腺癌类器官发现，BRCA1缺失类器官表现出上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）进程。缝隙连接蛋白43（Connexin43，Cx43）在人乳腺癌组织中普遍下调。当连接蛋白在癌细胞中过表达时，肿瘤生长减缓，细胞恢复一些分化结构的能力。
McLachlan等研究了MDA‐MB‐231类器官中的连接蛋白肿瘤抑制模式，为缝隙连接蛋白细胞间隙连接通讯（Gap junction intercellular communication，GJIC）对肿瘤的独立抑制作用提供了模型。Dekkers等靶向敲除正常乳腺类器官的抑癌基因，重述了乳腺癌的发生，增加了对乳腺肿瘤发生过程中关键驱动因素的认识。Bhatia等建立了一个来源于患者的肿瘤类器官（Patient-derived organoids，PDO）乳腺癌生物样本库，其中的类器官模型再现了大规模乳腺癌基因组，上述发现揭示了癌症驱动基因，为推测乳腺肿瘤发生的机制提供了见解。
2. 阐明肿瘤转移的关键机制
Cheung等通过培养乳腺癌类器官确定最早入侵的是高表达的CK14细胞。小鼠中CK14敲除的乳腺癌类器官失去了侵袭性，这为研究乳腺癌转移的起始机制奠定了理论基础。Nguyen-Ngoc等使用乳腺癌类器官模拟浸润性乳腺癌微环境发现，ECM诱导的信号变化可以启动侵袭和局部播散。
Cheung等发现，在人类乳腺癌的主要亚型中，表达基底上皮基因（如细胞角蛋白-14和p63）的特定癌细胞促进集体侵袭，表明上皮亚群之间的异型相互作用是集体侵袭的基础。Park等利用乳腺类器官分析其致癌功能，发现了3种与乳腺细胞增殖和侵袭相关的剪接因子。Diermeier等从恶性和健康小鼠组织生长的类器官发现，非编码RNA导致肿瘤生成的类器官的分支减少，发挥了癌症细胞迁移的特异性作用。
因此，以上研究通过对类器官基因敲除、模拟乳腺癌在体微环境阐明了乳腺癌侵袭转移机制。
3. 抗肿瘤药物筛选及开发
乳腺癌类器官的主要用途之一是药物测试[8,32]，即从患者样本产生的类器官系暴露于不同乳腺癌亚型的标准治疗。大多数依赖人表皮生长因子2受体（Human epidermal growth factor 2 receptor，Her-2）的类器官对Her-2靶向治疗敏感，而大多数不过度表达受体的类器官对Her-2靶向治疗耐药。
值得注意的是，尽管受体高表达，一些类器官被发现对Her-2靶向治疗耐药，这表明PDO中存在其他耐药机制，这与临床研究一致。体现了将基因组研究与类器官的体外分析相结合的价值。Walsh等使不同亚型BC/PDO接受对应的BC药物治疗，预测药物反应，发现与体内反应相似，也证实了类器官反应的异质性。
Chen等对76个乳腺癌类器官细胞系分成2组进行药物筛选。PDO药物表型分析显示，PDO对药物治疗的应答具有显著变异性。同时，使用6种微管靶向药物对57个乳腺癌类器官细胞系进行了RNA测序，结果表明，乳腺癌类器官对微管靶向药物的反应与其转录谱高度相关，能够预测特殊敏感药物。
4. 药物疗效与毒性评估
类器官可以预测异种移植的治疗反应，并测量来自人肿瘤的类器官的抗肿瘤药物反应，同时测试在患者匹配的正常组织上测试药物毒性。
光学代谢成像（Optical metabolic imaging，OMI）能够检测调节癌症细胞；Phan等在乳腺癌类器官模型下发到曲妥珠单抗下调乳腺癌中的乳酸脱氢酶，进而评估原发性乳腺肿瘤类器官对临床抗癌药物的反应。
在药物毒性评估方面，研究人员通过微芯片培养乳腺癌类器官表明，该方法检测不同抗癌药物细胞毒性的结果与传统的MTT法一致。
5. 指导乳腺癌个体化治疗
类器官为药物-基因型相关性的机制研究提供了一个良好的平台，使用CRISPR/Cas9技术来研究致癌转化和模型肿瘤发生。Matano等利用CRISPR/Cas9研究乳腺肿瘤，探索CRISPR/Cas9在brca1缺陷乳腺肿瘤中PARP抑制剂的反应机制。这将有助于在相关患者材料中研究单基因或多基因事件的影响。
04、中医药领域乳腺癌类器官应用展望
1. 中医药领域乳腺癌类器官的应用
恶性细胞的转录组谱高度依赖于微环境及肿瘤细胞的固有特性。类器官的基因组和转录组特征与原发肿瘤相比，能够明确类器官是否是肿瘤异质性的真实模型。乳腺癌细胞系在三维培养中所采用的形态至少部分地反映了其基因表达谱。类器官模式体系的产生，使器官的形态及功能在显微镜下同时观察成为可能，对于精准评价中药药效、明确药效作用靶标、揭示中药方药尤其是中药复方作用机制等具有重要意义。
中医药以整体观念、辨证论治指导临床实践，通过多途径、多靶点、多通路作用于人体，类器官以客观化、可视化、精准化为特点，应用干细胞，在体外构建了类似体内的组织器官模型，在模拟疾病发生发展、药物有效性筛选及新药研发、器官移植和再生医学等多个领域取得了突破。
类器官能再现体内微环境，评价药效、实时检测指标变化、发现潜在标靶及通路，同步进行作用机制的探索和验证，这与中医药整体观念、多靶点作用不谋而合，更能体现中医药从整体观诊疗的特色。现阶段，类器官生物库的建立为优化中药组方，预测中药在人体的不良反应，指导中医药精准治疗提供了新的方式，不仅能够用于某一病证组方的评价和优化，也是个体患者进行精准医疗的最佳模型。
2. 类器官在乳腺肿瘤的中医药研究中的作用
类器官在乳腺肿瘤的中医药研究中也有着重要作用。Koval等发现喀麦隆桃金娘科植物水桃在乳腺癌类器官中有强大的活性，通过对Wnt通路的抑制调节癌症细胞；Phan等在乳腺癌类器官模型下发现，香味草提取物可通过缺氧激活化疗药物对乳腺癌的治疗效果；Ye等发现白藜芦醇通过对乳腺癌类器官STAT3的激活抑制乳腺癌细胞的增殖；Zhang等发现，天然产物骆驼蓬碱（Harmine，HM）的先导化合物YH677通过调控TGFβ/Smad信号通路抑制CSCs的扩增，在PDO模型中通过剂量依赖抑制TNBC/EMT进程，发挥对TNBC生长和转移的抑制作用；
Liu等发现一种天然的CRM1小分子拮抗剂——传统草药萝卜的主要活性成分萝卜硫素，作为一种高效小分子拮抗剂在乳腺癌类器官中通过抑制STAT3信号通路对乳腺癌干细胞具有显著的活性，同时保护正常乳腺组织细胞；Lin等通过乳腺癌类器官模型发现，黄柏分离得到的一种天然黄连素型生物碱奥帕马汀通过对PI3K/AKT、MAPK、VEGFA-VEGFR2通路的干预影响乳腺癌发展的进程；
Shan等发现，药用真菌纤孔菌属的乙醇提取物三萜类化合物通过对乳腺癌类器官JAK2/STAT3信号轴的抑制，起到抗乳腺癌活性的作用；Deng等通过黄芪的有效活性分子环黄芪醇（Cycloastragenol，CAG）干预恶性肿瘤PDO发现，CAG联合PD-1抗体增强了类器官中CD8+T细胞的杀瘤能力；
Xu等通过对恶性肿瘤的基因小鼠模型及PDO模型中添加传统草药白术的小分子化合物白术内酯1（Atractylenolide，ATT-1）发现，ATT-1能够增强免疫蛋白酶体活性，促进肿瘤抗原呈递给CD8+T细胞并提高基于抗PD-1的免疫疗法的功效；雷公藤酚（Celastrol，CEL）是分离自雷公藤的一种天然五环三萜类化合物，CEL通过对STAT3的抑制，抑制肿瘤类器官的活性，起到强效抗肿瘤作用，CEL有可能成为癌症治疗中有前途的STAT3抑制剂。
Fan等使用心脏肥大的类器官模型评估了中药提取物冠心宁注射液的机制和药效学影响。Chen等建立肠道类器官并表明，甘草次酸增加人抗原R和下游增殖相关核抗原Ki67的水平，以促进肠道类器官的发育并维持肠道稳态。结直肠癌类器官的建立，筛选出雷公藤酚抑制类器官生长，强于阳性药物L-OHP。
中医药治疗和类器官在个体化精准治疗上理念一致，且中医药种类繁多，为类器官研究提供了丰富的选择。
05、结语
有效模拟细胞功能和疾病对临床医学研究至关重要。类器官是一个值得期待的优势工具，尤其对于恶性肿瘤类疾病的帮助远大于二维细胞系及PDX。目前，类器官在乳腺癌的发生发展、转移机制探索上已经取得了可观的进展，阐明了关键基因与细胞在乳腺癌中的作用机制。
但是，类器官在乳腺癌肿瘤微环境中相关的基础研究仍相对不足，或可做进一步研究，以便更加真实的反应乳腺癌肿瘤微环境在肿瘤发病过程中的病理生理改变，目前抗肿瘤的标准治疗是针对癌细胞，通过对肿瘤微环境的研究有助于肿瘤治疗的进一步完善，起到直接针对肿瘤微环境中受调节的细胞群的作用，为临床药物治疗及新药开发提供新思路；在临床中对于乳腺癌抗肿瘤药物的筛选、新药开发、疗效的评价、毒性的甄别也有着广泛的应用，反馈于临床患者，促进肿瘤患者肿瘤的消散、减轻手术风险的发生、减少术后复发转移的可能、有效延长了患者的生存期。
在中草药方面，乳腺癌类器官的研究较为缺乏，中药单体及有效成分仍停留在对于乳腺癌肿瘤类器官的肿瘤杀伤作用，后续的研究可以着眼于对通路的阻断、机制的调节、蛋白合成的干预；中药含药血清、中药冻干粉、中药药对及复方作为中医肿瘤体外干预方法，目前在乳腺癌相关的类器官中尚未见较为系统的研究，或可为中药干预乳腺癌类器官的基础及临床研究提供新思路，也可为中药选方通过客观依据；不可忽视的是，类器官实验中的中药剂量和给药方式也需进一步验证，为后期研究工作的开展提供借鉴。
在中医药方面，乳腺癌类器官的研究尚处于起步阶段，相关研究相对不足，可以利用类器官构建更加符合真实世界的BC患者发病的病理生理学的疾病模型，寻找潜在的治疗靶点、作用机制及信号通路，为中医药防治乳腺癌提供更加真实的实验数据，加快中医药防治乳腺癌的研究。
中医对于乳腺病的诊疗强调脏腑内外、表里之间的联系，从冲任入手，诊疗乳腺的同时兼顾于整体调节，这与西医学中的激素调节轴：甲状腺-乳腺-子宫轴相互贴合，也为中医的“辨证论治”提供科学依据，或可在乳腺癌的中医证候特征和机制研究中发挥重要作用。
类器官的根本仍是体外模型，缺乏在人体内时的血管、神经、免疫系统及其相互间的联系，而乳腺癌的中医证候是乳腺肿瘤发展到某个阶段病因、病位、病势、邪正关系等一系列病理变化的总称，是在中医“整体观念”指导下的一种概括，二者本质上存在差异，同时对于中医药改善免疫功能的研究，单独的类器官构建也是无法模拟机体的免疫状态。因此，结合类器官芯片技术构建、模仿激素调节轴，模拟乳腺癌状态下的机体生理病理功能及免疫反应，结合中医整体观念指导临床诊疗，为整体评价中医药治疗乳腺癌的科学性提供了可能。
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