基因工程细胞的同质性对于很多应用都是必要条件，例如细胞株开发、基因治疗、组织工程以及细胞治疗与再生医学。CRISPR/Cas9基因编辑存在脱靶等情况，无法直接得到均质的细胞，因此需要开展单细胞克隆，之后才能用于临床。

CloneSelect单细胞分离系统（CloneSelect Single Cell Printer）采用类似喷墨打印的技术，柔和地产生包裹细胞的液滴无接触地直接分配到微孔板中（图1）。同时，该系统借助智能图像分析，确认细胞数目，分析细胞的形态（大小和圆度）及荧光强度，联动的真空装置将不符合要求的液滴（如空液滴或者含多个细胞的液滴）直接吸走，而符合要求的细胞液滴则分配至微孔板，从而实现对单个细胞的分选和接种。单细胞分离系统是一种可比移液器操作的柔和的单细胞分离技术，而流式分选由于高的液体剪切力和电压的影响，会降低敏感细胞和部分受损细胞（如电转后的细胞）的成克隆率，因此单细胞分离系统更适用于基因工程细胞的克隆，维持细胞活力，并提供直接的单克隆性图像证据。

图1：CloneSelect f.sight单细胞分离系统

最近发表的一篇文章（Characterization of CRISPR/Cas9 RANKL knockout mesenchymal stem cell clones based on single-cell printing technology and emulsion coupling assay as a low-cellularity workflow for single-cell cloning），作者用CRISPR/Cas9对间充质干细胞（MSC）开展RANKL基因敲除以提高其骨骼形成能力。整个实验流程起始于转染，接着用CloneSelect f.sight单细胞分离系统开展单细胞克隆，随后在DNA、RNA以及蛋白质水平开展分析，最后开展细胞功能分析（图2）。

图2：基因编辑间充质干细胞的单细胞克隆及分析流程。（图片来源：文献1）。

作者在CRISPR/Cas9基因敲除质粒中加入了GFP基因，转染间充质干细胞后，用具备荧光分选功能的CloneSelect f.sight系统分选出转染成功的单细胞。系统可设定细胞直径、圆度和荧光强度等指标，分选出单个活细胞并接种至微孔板。图3为系统分选基因编辑的间充质干细胞的5张连续的图像。通过浏览单细胞分离过程中记录的5张连续的图像，作者统计单细胞接种的成功率为93.9±2.7%（n=451），即仅有~6%的孔为多细胞孔，或空孔或无法确认（图4）。这一结果表明f.sight单细胞分离系统可以准确地识别细胞并成功将其接种至微孔内。

图3：CloneSelect f.sight系统分选间充质干细胞时采集的5张连续图像，可用于证明单克隆性。（图片来源：文献1）。

除了带GFP的基因敲除质粒外，作者还将pmaxGFP质粒转染至间充质干细胞作为对照用于评估单细胞分离效率和克隆率。此外，作者转染了多个不同的基因敲除质粒。虽然不同的质粒因为大小不同而呈现各异的转染效率，但是成克隆率都达到了30%。此外，作者还发现转染质粒的间充质干细胞（31.3±8%）和未转染的间充质干细胞（39.6±15.6%）在成克隆率上差异较小，这也表明f.sight的单细胞分选过程柔和，因此产生的系统偏差较小（图4）。

图4：CloneSelect f.sight单细胞分离系统的高接种效率（左）和高成克隆率（右）。（图片来源：文献1）。

接着作者采用surveyor assay、RT-PCR和emulsion coupling分别从DNA、RNA和蛋白质水平对基因编辑后的间充质单细胞开展分析。最后作者选出一株双等位基因敲除的间充质干细胞（g23d）检测其成骨分化的能力，并以未编辑的MSC为对照开展平行实验。细胞转移到成骨分化培养基后，分别在第7天、14天和21天用茜素红染色。在第14天，细胞失去细长的成纤维细胞样形态，开始呈现出成骨细胞样的形态，然后在第21天开始出现钙沉积，发展过程与亲本的MSC对照类似（图5）。这表明基因编辑后的MSC其成骨分化能力并没有因为基因编辑和筛选过程而受到影响。

图5：RANKL基因敲除的间充质干细胞（g23d）和亲本间充质干细胞的培养和成骨分化。（图片来源：文献1）。

在这个研究中，作者搭建了一整套实验流程，起始于CRISPR/Cas9基因编辑，单细胞克隆以及DNA、RNA和蛋白质各个水平的分析和细胞功能测试。实验流程中采用CloneSelect f.sight单细胞分离系统成功高效地分选出基因编辑后带GFP的间充质干细胞。单细胞接种效率高达93.9% (± 2.7%)，且成克隆率高达31.3% (±8%)。相比传统的有限稀释法和流式分选，CloneSelect单细胞分离系统具有高效率，高活率，操作简单，单克隆性证据充分等优势，是基因工程细胞克隆的理想工具。