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1区 IF: 21|云序MeRIP-Seq & RIP-Seq助力肺动脉高压中m6A阅读蛋白YTHDF1机制研究

作者:上海云序生物科技有限公司 2021-11-22T10:08 (访问量:7277)

N6-甲基腺苷(m6A)是最普遍的mRNA内部修饰,通过甲基化酶(writer)、去甲基化化酶(eraser)和阅读蛋白(reader)的合作参与细胞过程。m6A对mRNA下游调控如翻译、输出和稳定性的影响主要由识别修饰靶点的reader决定。云序客户南京医科大学陈峰课题组在American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 杂志(IF=21.405)上发表了关于m6A reader蛋白在肺动脉高压(PAH)发病机制中作用的文章,展示了人类PAH患者和实验性PH模型中m6A水平和YTHDF1 reader蛋白表达,YTHDF1 reader蛋白的机制作用,并表明针对YTHDF1或MAGED1的策略可能是治疗PH的有效疗法。云序生物有幸参与本项目当中的m6A MeRIP-seqRNA-seqRIP-seq以及生信分析。
下面我们就为大家解析这篇研究reader蛋白的文章思路和成果。
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发表期刊:American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine
发表日期:2021年5月1日
影响因子:21.405
研究方法:比色法检测m6A整体水平m6A MeRIP-seqRNA-seqRIP-seqMeRIP-qPCR
文章链接:YTHDF1 Regulates Pulmonary Hypertension through Translational Control of MAGED1

 技术路线

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 研究内容
一、m6A修饰水平在人类PAH患者和实验性PH模型中上调
首先,作者用比色法检测了PAH患者(n=7)和Su/Hx诱导PAH小鼠的肺组织(n=8)、MCT诱导大鼠的肺动脉组织(n=8),发现与对应的健康组织相比整体m6A甲基化水平上调。同时,也发现在PAH组织中,m6A reader蛋白YTHDF1的表达上调。并且,YTHDF1蛋白表达量和RNA整体m6A水平都随着缺氧时间一起增加。这些结果提示了YTHDF1与m6A修饰可能参与了PH病理生理过程。
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二、YTHDF1基因敲除改善PH
为验证YTHDF1对PH病理生理过程的影响,一方面作者在小鼠中敲降YTHDF1进行Su/Hx诱导PH实验,通过血液动力学、肺动脉血管壁厚度和肌化、肺动脉平滑肌细胞增殖等指标,发现敲降YTHDF1可改善小鼠PH和PVR发展。另一方面,目前已知PASMC细胞表型转化在PH的发病机制中起重要作用,作者在 HPASMC中敲降YTHDF1,发现可改善细胞增殖、表型转换和凋亡抵抗。
图2.png

三、YTHDF1蛋白表达增加与蛋白降解改变有关
有趣的是,作者发现虽然YTHDF1蛋白表达量在PH患者和动物模型中上调,但是YTHDF1的mRNA却不变甚至轻微下调。于是作者通过转录抑制实验和蛋白合成抑制试验在HPASMCs中验证到,缺氧诱导PH过程中YTHDF1转录本稳定性不变而蛋
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四、MAGED1是Su/Hx处理小鼠m6A修饰和YTHDF1的靶点
为了寻找YTHDF1作用的靶基因,作者对Su/Hx诱发PH的小鼠和对照小鼠进行了m6A MeRIP-seq、RNA-seq和RIP-seq。m6A修饰谱展现了m6A位点多分布在终止密码子,甲基化峰保守序列分析显示RRACH序列显著富集。对三组学差异基因取交集后进行了GO和KEGG分析。

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图片处理组m6A修饰水平上调且与YTHDF1结合的基因中,MAGED1基因的功能与细胞凋亡、分化和增殖相关,筛选其为潜在靶基因。与对照组相比,在Su/Hx处理小鼠中,作者通过MeRIP-qPCR验证了MAGED1的m6A修饰水平升高,通过RIP实验验证到结合YTHDF1的MAGED1蛋白更加富集。另外,同样进行Su/Hx处理,在敲降YTHDF1的小鼠MAGED1蛋白表达量低于野生型。这些结果表明,Su/Hx诱导PH的模型小鼠中,MAGED1蛋白经由m6A修饰受YTHDF1调控。
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五、YTHDF1识别并促进m6A修饰的MAGED1 mRNA的翻译
接下来作者探究了YTHDF1调控MAGED1的机制。作者观察到在患者和小鼠模型中,MAGED1蛋白水平随着促PH因子的作用而升高,但MAGED1基因mRNA却没有显著差异。于是针对YTHDF1作者1) 通过RIP-qPCR发现缺氧诱导PH的小鼠中YTHDF1结合的MAGED1 mRNA更加富集; 2)通过敲降和过表达YTHDF1发现影响MAGED1蛋白表达而不是mRNA水平;3)通过CHX处理区分验证了HPASMCs中过表达YTHDF1不改变MAGED1蛋白降解速率,说明YTHDF1是通过影响翻译效率实现提高MAGED1蛋白表达。除此之外,作者还在过表达YTHDF1的HPASMCs中敲降了甲基化酶METTL3,发现会减弱YTHDF1促进MAGED1蛋白表达的效果。这些实验结果证明,YTHDF1通过促进带有m6A修饰的靶基因MAGED1的蛋白翻译效率从而增强其蛋白表达。
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六、靶基因MAGED1对PH的促进作用
最后作者研究了靶基因MAGED1对PH病理生理过程的影响。通过动物实验和细胞实验,验证了敲降MAGED1对PH小鼠血管重塑和心功能损害具有保护作用,进一步又验证了MAGED1通过上调PCNA促进缺氧状态下PASMC的细胞增殖、迁移和存活。
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总结

这篇文章首先通过比色法检测了PH中整体m6A修饰水平上调,m6A reader蛋白YTHDF1表达上调,揭示了m6A修饰在PH病理生理学中的潜在作用。然后通过云序生物提供的m6A MeRIP-seq、RNA-seq、RIP-seq寻找m6A修饰和受YTHDF1调控的靶基因MAGED1。在疾病患者、模型小鼠、PASMC细胞中,一方面验证了YTHDF1 reader蛋白在疾病中表达提高,另一方面从结合mRNA、调控mRNA和蛋白表达水平等方面,验证了YTHDF1通过m6A修饰促进靶基因MAGED1的蛋白表达。最后验证了靶基因MAGED1对PH的促进作用。本研究首次将m6A水平和YTHDF1丰度的增加与PH的发展联系起来,并表明针对YTHDF1或MAGED1的干预可能是治疗PH的有效方法。
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云序生物m6A修饰研究五大模块
01 m6ARNA修饰测序
m6A RNA修饰测序(m6A-MeRIP-seq)
对m6A RNA甲基化,目前最流行的检测手段为m6A-Seq技术,适用于m6A RNA甲基化谱研究,快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序:
  • m6A 全转录组测序(涵盖mRNA,LncRNA,circRNA)
  • m6A LncRNA测序(涵盖LncRNA和mRNA)
  • m6A Pri-miRNA测序(涵盖Pri-miRNA和mRNA)
  •  m6A  mRNA测序
  • m6A  miRNA测序

02 检测整体m6ARNA修饰水平

 LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效,可以实现一次检测,9类修饰水平检测,一步到位。
比色法检测整体RNA修饰水平
快速检测m6A整体甲基化水平

03 m6A RNA修饰上游酶的筛选

 m6A RNA修饰相关酶PCR芯片

寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m6A RNA修饰靶基因验证
MeRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的MeRIP-qPCR服务,可针对mRNA,lncRNA,环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测,低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点,研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白,研究相应的分子调控机制。
5.3 双荧光素酶实验
验证两基因互作,研究相应的分子调控机制。
5.4 ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA互作,研究相应的分子调控机制。

云序生物服务优势

优势一:发表10分以上文章最多的m6A RNA甲基化测序服务平台。云序已累计支持客户发表57篇高水平RNA修饰文章,合计影响因子480分+,是国内支持发文最多、累计影响因子最高的公司。
优势二:至今完成4000+例 m6A测序样本,全面覆盖医口、农口等各类样本。
优势三:全面检测mRNA和各类非编码RNA(circRNA,lncRNA,Pri-miRNA等)。
优势四:独家提供m6A一站式服务:m6A整体水平检测m6A测序MeRIP-qPCR验证、RIPRNA pull-down等。
优势五:率先研发超微量MeRIP测序技术,RNA量低至500ng起。
优势六:国内最全的RNA修饰测序平台,提供m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。

云序客户RNA修饰部分文章列表
客户文章列表m6A 5分以上35篇.png
 
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