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m6A阅读器YTHDF1介导EIF3C翻译促进卵巢癌进展

作者:上海云序生物科技有限公司 2020-03-04T10:23 (访问量:4536)

​文章导读
m6A是真核生物中最常见的一类RNA修饰,能够在多种生物过程中发挥重要作用,例如癌症发生发展、细胞分化、压力应答、免疫反应以及神经发育等。2019年m6A修饰曾创下单月发表100+篇10分影响因子的辉煌。2020年1月何川教授团队再次带领m6A登上顶级期刊Science,预示着m6A等RNA修饰将继续引领新一年的科研热点。
目前大部分研究主要探究m6A对蛋白编码基因的调控——即影响mRNA稳定性或翻译效率。2020年1月30日高分期刊Nucleic Acids Research上再次发表论文,证实 m6A阅读器YTHDF1能够增强EIF3C的翻译促进其表达,进而加强卵巢癌细胞整体翻译水平,促进卵巢癌的恶性进展。

原文链接:The m6A reader YTHDF1 promotes ovarian cancer progression via augmenting EIF3C translation
发表期刊:Nucleic Acids Research
影响因子:11.147
发表日期:20200130
运用技术:RNA-seqMeRIP-seqRIP-seqRIP-qPCR等(云序提供以上服务)
文章内容
1.YTHDF1在卵巢癌中高表达
为了研究m6A在卵巢癌发展中的作用,作者首先使用TCGA数据集分析了m6A相关的酶在卵巢癌中的遗传变异和表达水平,其中YTHDF1基因扩增最频繁且其表达显著升高。接着,作者根据两个GEO数据集(GSE66957和GSE54388)分析了YTHDF1在卵巢癌中的表达,发现与正常卵巢上皮细胞相比,YTHDF1在卵巢癌中表达上调。

图1 YTHDF1在卵巢癌中高表达
2. YTHDF1调节卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭
为了探索YTHDF1在卵巢癌中的功能,作者沉默YTHDF1后检测卵巢癌细胞的表型。通过CCK8分析发现,YTHDF1的沉默显著影响了A2780和SKOV3卵巢癌细胞的生长。此外,EdU染色表明,在YTHDF1沉默后,卵巢癌细胞的增殖显著降低。同样,克隆形成实验克隆形成实验表明,敲除YTHDF1后细胞的生成能力受到抑制。此外,细胞迁移和侵袭实验表明,YTHDF1沉默会降低细胞的迁移和侵袭能力。这些结果:表明,YTHDF1在卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭中起重要作用。

图2 YTHDF1调节卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭
3. YTHDF1沉默抑制体内卵巢癌细胞的发生和转移
为了评估YTHDF1在体内卵巢癌中的致癌作用,作者应用了小鼠裸鼠成瘤实验进行了探究。首先,将YTHDF1缺陷型A2780卵巢癌细胞和对照细胞分别皮下注射到裸鼠中。4周后,处死小鼠并分离肿瘤。源自YTHDF1缺陷型组的肿瘤明显小于对照组。同时,与对照小鼠相比,具有YTHDF1基因敲低的小鼠的平均肿瘤体积和处死时的重量明显降低。作者还评估了这些实体瘤中的细胞增殖和凋亡指数。与对照细胞相比,YTHDF1沉默的肿瘤中Ki-67信号降低,caspase-3活性增加。注射YTHDF1沉默细胞,可大大消除细胞在腹腔内形成继发性肿瘤的能力。这些结果共同证明了YTHDF1在卵巢癌中的致癌作用是通过调节细胞增殖和转移来实现的。

图3 在卵巢癌中YTHDF1通过调节细胞增殖和转移致癌
4. 寻找YTHDF1靶基因--EIF3C
为了探索YTHDF1在卵巢癌发展中的潜在机制,作者分别对YTHDF1敲除和对照组的A2780细胞进行了RNA-seq(云序提供此服务)。分析结果发现了1715个差异表达的基因,包括633个上调基因和1082个下调基因。同时,作者对过表YTHDF1的A2780细胞分别进行了m6A-seqRIP-seq(云序提供此服务)。通过m6A-seq分析,作者从3990个基因中鉴定出8104个m6A峰,这些m6A修饰主要位于mRNA中(91%),并在终止密码子附近富集。RIP-seq揭示了1698个潜在的YTHDF1候选靶基因,其中93%是mRNA。RNA-seq、m6A-seq和RIP-seq取交集后发现,与YTHDF1结合的693个基因被m6A标记,其中647个(93.4%)基因表达未发生改变。这些结果表明YTHDF1不会影响其靶基因的RNA丰度,与前人研究一致。此外,功能注释显示这647个基因参与了多个RNA代谢过程,包括翻译、mRNA剪接和RNA稳态。
为了全面探索YTHDF1及其靶基因之间的直接相互作用,作者对过表YTHDF1的A2780细胞,进行了eCLIP-seq,并鉴定了2,343个目标转录物,这些转录物大多数是mRNA。将eCLIP seq的结果2,343个基因和上面三组数据交集确定的647个基因取交集,产生175个基因,将其确定为YTHDF1的直接结合靶基因。接下来,作者分析了175个基因上,m6A峰和YTHDF1结合mRNA上的eCLIP峰的分布。作者发现这些转录本中的大多数YTHDF1结合位点(包括EIF3C)都与m6A位点非常吻合。GO分析表明,结合YTHDF1的转录本与翻译调控最密切相关。EIF3C是真核转录起始因子EIF3的亚基之一,其翻译控制有助于肿瘤发生。此外,EIF3C与多种癌症(包括肝细胞癌,结肠癌和乳腺癌)的恶性行为相关。CLIP-qPCR还显示YTHDF1最显著富集EIF3C mRNA。这些数据表明EIF3C是YTHDF1在卵巢癌细胞中的直接靶标。

图4 YTHDF1靶基因鉴定m6A测序数据展示
5. YTHDF1调节卵巢癌细胞中EIF3C的表达和整体蛋白合成
为了确认YTHDF1调节卵巢癌细胞中EIF3C的表达,作者沉默YTHDF1后,探究了EIF3C的转录和翻译水平。如预期的那样,YTHDF1沉默可降低EIF3C的蛋白质丰度,而不会影响EIF3C的mRNA水平。接着,利用RIP-qPCR(云序提供此服务)证实了YTHDF1和EIF3C mRNA之间的相互作用。然后,作者针对YTHDF1和EIF3C mRNA的结合位点设计突变(YTHDF1-mut),RIP-qPCR发现YTHDF1突变体与EIF3C mRNA之间的相互作用显著降低。蛋白质印迹分析显示,YTHDF1-wt可以增强EIF3C的表达。
由于EIF3C是蛋白质合成所必需的EIF3复合物的关键亚基,因此作者接下来探讨了YTHDF1是否会影响卵巢癌细胞的整体蛋白合成。为了测试这一点,作者使用HPG掺入法分析新蛋白质的合成。与对照细胞相比,EIF3C敲低后掺入到合成蛋白中的HPG在下降。同样,与对照细胞相比,YTHDF1沉默的细胞也显示HPG信号下降,这表明YTHDF1可以影响整体蛋白质合成。总的来说,这些数据表明YTHDF1通过调节卵巢癌细胞中的EIF3C蛋白表达来影响整体蛋白合成。

图5 YTHDF1以m6A依赖性方式调节EIF3C翻译
6. 回补EIF3C可改善YTHDF1沉默对卵巢癌细胞的抑癌作用
作者检测卵巢癌组织中EIF3C的蛋白表达,发现EIF3C在卵巢癌中的蛋白表达显著升高。
EIF3C敲低后,细胞生长、集落形成能力、细胞迁移和侵袭均受到明显抑制。这些结果表明,EIF3C促进了卵巢癌的肿瘤发生。接着,作者在沉默YTHDF1的A2780和SKOV3细胞中过表达EIF3C,YTHDF1沉默会抑制细胞生长、集落形成、细胞迁移和侵袭,而EIF3C的回补则可以逆转这种抑制作用。这些结果表明,EIF3C是YTHDF1促进卵巢癌进展的关键下游靶标。最后,作者分析了卵巢癌组织中EIF3C蛋白表达与YTHDF1蛋白表达之间的相关性,发现YTHDF1的蛋白质丰度与EIF3C的表达呈正相关。以上结果显示,YTHDF1表达增加可以调节EIF3C翻译进而增强整体蛋白质合成,并促进卵巢癌细胞的肿瘤发生。

图6 YTHDF1依赖EIF3C促进卵巢癌细胞的生长和迁移
总结:
M6A甲基化是哺乳动物mRNA中含量最丰富的RNA修饰,越来越多的证据表明m6A在人类肿瘤发生中起着关键作用。本文,作者利用RNA-seqMeRIP-seqRIP-seq等多种技术联合分析,发现甲基化识别蛋白YTHDF1的直接靶点--蛋白质翻译起始因子eIF3的一个亚基EIF3C。YTHDF1通过与m6A修饰的EIF3C mRNA结合,以m6A依赖的方式增加EIF3C的翻译,同时促进整体蛋白合成,从而促进卵巢癌的发生和转移。本文确定了对卵巢癌进展至关重要的新的YTHDF1-EIF3C轴,为开发癌症治疗提供新的靶点。

图7 YTHDF1介导的EIF3C翻译在卵巢癌中的作用
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云序生物作为国内最早做m6A的科研平台,至今用户已发表10多篇m6A相关文章,其中多篇影响因子超过10分。云序生物RNA修饰高通量测序产品覆盖面广,包括编码mRNA和非编码lncRNA,circRNA,microRNA等分子。云序生物既提供针对单个分子的m6A测序,也提供一次检测多种RNA分子m6A修饰的全转录组测序,此外公司长期致力于提供优质前沿表观研究测序产品,结合最新科研热点继m6A、m5C、m1A之后,隆重推出多款RNA新修饰,不仅有m7G测序,还包括m3C测序、ac4C乙酰化测序和2'-O-甲基化测序,打造了全修饰和全分子覆盖的研究平台。

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利用m6A特异性抗体,通过免疫共沉淀技术(MeRIP方法)特异性富集发生甲基化修饰的RNA,与不处理组(Input)做对比,对m6A修饰进行高通量测序和peak峰定位。

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