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碱性磷酸酶ELISA方法

作者:上海化科实验器材有限公司 2013-09-11T00:00 (访问量:4539)

  实验原理:

  1. 在ELISA测定中,碱性磷酸酶的色原底物是对**苯磷酸盐(p-nitropheny-phosate,pNPP)。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对**酚(pNP),其在入=405 nm处有最大吸收。

  2. 由于较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性,所以用TBS体系,不能用含磷酸根丰富的PBS体系,否则会造成本底偏高。

  3. 由于碱性条件下pNP的光吸收增强,并可使碱性磷酸酶失活,因而可使用氢氧化钠作为终止剂。

 

 试剂:

  ELISA溶液体系:

  1XTBS 1L体系

  H2O 定容至1000ml

  Tris-HCl 6.06g 50mM 盐酸调 PH 7.5

  NaCl 8.76g 150mM

  包被液:

  0.1M NaHCO3 (pH9.6)。过滤除菌,4℃贮存。

  显色液:

  1. 0.1M glycine pH 10.4 + 1mM MgCl2 + 1mM ZnCl2

  配方:7.51g glycine + 203 mg MgCl2 + 136 mg ZnCl2 + 980 ml H2O,用浓NaOH溶液调至pH10.4,补水定容到1L。

  2. 1 M diethanolamine(二乙醇胺)pH 9.8+ 0.5mM MgCl2

  配方:97 ml of diethanolamine +100 mg MgCl2 + 800 ml H2O,用浓HCl溶液调至pH9.8,补水定容到1L。

  显色液中pNPP终浓度为1mg/ml。

  终止液:

  配方:3M NaOH。

  实验步骤:

  1. 包被:用包被液稀释靶分子,4℃过夜或者37℃ 1h。TBS洗3次。

  2. 封闭:2%M-TBS 37℃ 1h。TBS洗3次。

  3. 结合:将表达菌用TBS重悬,超声后加入到孔中,37℃ 1h。0.5%TBST洗3次。

  4. 显色:将显色液加入到孔中,3M NaOH终止(100ul显色液+25ul终止液)

  实验结论:

  两种显色液显色时间有区别,显色液1显色较慢,适合检测表达量较高或结合活性高的样本,同时实验平行性较好;显色液2显色较快,灵敏度较高。

 

 

 

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