该团队先前的研究揭示gga-miR-375在禽类白血病病毒J亚群(ALV-J)感染的鸡肝脏肿瘤中表达显著下调。结合当下的研究热点认为gga-miR-375可能与circRNA有关。在本研究中，环状RNA测序结果显示，在感染ALV-J的鸡肝脏肿瘤中，circ-Vav3显著上调。进一步通过RIP、生物素RNA pull down和RNA-FISH实验证实circ-Vav3是gga-miR-375的海绵。此外，研究者通过双荧光素酶报告基因检测证实YAP1是gga-miR-375的靶基因，并且进一步验证了circ-Vav3通过海绵吸附作用释放gga-miR-375的靶基因YAP1，进而通过circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1轴影响上皮间质转化（EMT）过程以促进肿瘤的发生，并在临床样本中得到了验证。

研究内容：
1.circRNA表达谱及其结合位点预测

研究人员以ALV-J感染的鸡肝为测序样本，通过环状RNA测序（由云序生物提供）检测到有2822个circRNAs呈现差异性表达，其中2808个circRNAs显著性上调。并通过聚类图、火山图和散点图对25种表达上调的circRNAs进行生信分析，发现circ-Vav3上调最显著。此外，该团队先前的研究揭示了同样的样本中gga-miR-375下调最明显。接下来利用TargetScan和miRanda软件对25种circRNAs可能结合的miRNAs进行生信预测，结果显示其中circ-Vav3与gga-miR-375结合的评分最高。

2.circ-Vav3海绵吸附gga-miR-375

circ-Vav3的命名主要是基于该环状RNA来源于Vav3基因的8-11号外显子；预测结果显示circ-Vav3与gga-miR-375之间存在完美的靶向位点。利用海绵机制指示蛋白进行AGO2 RIP实验（由云序生物提供），对捕获的AGO2蛋白进行qPCR检测发现circ-Vav3与gga-miR-375显著富集；同时利用circ-Vav3探针进行RNA pull down实验（由云序生物提供）检测出了gga-miR-375的结合情况。RNA-FISH实验证实了circ-Vav3主要存在细胞质，而gga-miR-375即存在于细胞质又存在于细胞核，揭示了circ-Vav3和gga-miR-375通过相互结合发挥调控作用。

3.gga-miR-373 通过与YAP1的3’UTR区结合负调控YAP1的表达，并且过表达gga-miR-375可减弱EMT

生信预测揭示YAP1是gga-miR-375的潜在靶基因，进一步的双荧光素酶报告基因证实了gga-miR-375可通过结合YAP1的3’UTR区抑制YAP1的表达；在体外细胞系DF-1中过表达gga-miR-375可明显下调YAP1的mRNA和蛋白水平，揭示了gga-miR-375通过直接结合YAP1的3’UTR区，抑制YAP1基因的表达。EMT现象是肿瘤发生转移的前兆，该过程伴随着关键基因的上调（N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1）和下调（E-cadherin）。通过过表达gga-miR-375发现可以显著上调EMT正相关的基因的mRNA和蛋白水平，下调负相关基因的mRNA和蛋白水平，并且证明了EMT相关基因并不是gga-miR-375的直接靶基因。所以gga-miR-375是通过抑制YAP1基因的表达间接抑制EMT的进程。

4.YAP1过表达促进EMT，使细胞迁移能力增强

研究者进一步通过Transwell实验证明了过表达YAP1可显著增强细胞的迁移能力，同时qPCR和WB也证实在YAP1过表达的DF-1细胞系中，EMT相关的关键基因表达情况发生了明显的改变，说明YAP1可促进EMT的发生和细胞迁移能力。

5.circ-Vav3海绵吸附gga-miR-375上调靶基因YAP1从而促进EMT

经过前期工作的积累，研究人员认为circ-Vav3在胞浆中海绵吸附gga-miR-375，从而上调YAP1和EMT相关基因的表达。共表达实验显示，相对于过表达gga-miR-375和LCDH-circ-EV（空载组），而过表达gga-miR-375和LCDH-circ-Vav3（实验组）的EMT正相关基因（Fibronectin, N-cadherin, MMP2, ZEB1和Vimentin）的蛋白和mRNA水平明显上调，而负相关基因（E-cadherin）的蛋白和mRNA水平明显下调；更加证实了circ-Vav3通过海绵作用吸附gga-miR-375，上调其靶基因YAP1的表达，进而诱导EMT的发生。