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选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性很重要。PBS的缓冲能力强于TBS，TBS在pH7.0以下缓冲能力较弱。一般根据实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液首选PBS。Western blot中使用PBS和TBS均可，根据需要选择合适的浓度。 | |
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不一定，因为有的抗体是识别线性表位的，有的是识别构象型表位，识别构象型表位的抗体不能用于Western blot，因为在Western blot中抗体识别的是完全变性的蛋白质抗原，而蛋白质抗原的构象型表位变性时被破坏。 | |
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最好不要同时加两种一抗，因为如果结果里面有非特异性信号的话，就说不清楚。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗、ECL显色、压片、洗片，漂洗后加内对照的一抗、二抗、ECL显色、压片，洗片。 | |
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可以考虑，转移缓冲液中加入20%甲醇，因为甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液中加入终浓度0.1% SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜，低浓度胶，提高转移电压/电流，增加转移时间。 | |
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一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致，这样才有说服力。表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或人为造成目的条带浓度的变化，严格意义上讲，内参是必须的。 |
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