一、 目的
掌握真核生物基因组DNA的提取方法。
二、 原理
高产量和高纯度的真核生物DNA分离技术是进行PCR、Southern杂交、DNA文库构建,及许多其它分子生物学研究的前提条件。真核生物基因组DNA位于细胞核内,与细胞核蛋白结合在一起。要提取真核细胞基因组DNA,必须去除与核酸结合的蛋白质、多糖、脂类以及RNA等生物大分子。采用组织匀浆法破碎细胞,在SDS和EDTA溶液中,以蛋白酶K消化细胞的蛋白质。该方法虽然传统、简单,但却行之有效;不仅实验操作具有相当大的灵活性,而且不需昂贵的仪器设备。其中SDS能破坏核膜使DNA释放入水溶液,还可破坏细胞膜上的脂肪和蛋白质,并与蛋白质结合成复合物从而使蛋白质变性沉淀;EDTA螯合Mg2+, Ca2+等金属离子,抑制DNA酶对DNA的降解作用。这样大分子DNA在乙醇中便以絮状物析出,离心沉淀后再用70%的乙醇洗涤除盐,干燥后溶于TE或双蒸水中。以此法制备的DNA大小一般为40~150kb。
三、 仪器材料
(一)仪器
1.恒温水浴锅(北京医疗设备厂,型号:BS2-I)
2.高速离心机(Hema,型号:TGL-16H)
3.冷冻高速离心机(珠海黑马医学仪器有限公司,型号:TGL-18R)
4.-20℃冰箱(海尔集团青岛电冰柜总厂 型号:BD-198S)
5.液氮罐(成都液氮容器厂,型号:YDS-35-125)
6.匀浆器
7.自动制冰机 (意大利SCOTSMAN公司 型号:AF-10)
(二)材料
1. 动物或人的组织标本
2. 人的血液标本
四、 试剂
1. DNA抽提缓冲液:
1.0 mol/L Tris-HCl (pH8.0) 50 ml
0.5mol/L EDTA (pH8.0) 2.0 ml
1.0M NaCl 100ml
10% SDS 50 ml
水 298ml
2.液氮
3.蛋白酶K(20mg/ml):0.2g蛋白酶K溶于10ml水中。工作浓度100-200μg/ml。
4.平衡酚
5.氯仿
6.3M乙酸钠(pH4.8):称取40.81g三水乙酸钠溶于80.0ml水中,用冰乙酸调节pH值至4.8,定容至100ml。
7.预冷的100%乙醇
8.预冷的70%乙醇
9. 预冷的0.01M的PBS
五、方法
(一) 组织细胞基因组DNA的提取
1. 取新鲜组织或冰冻组织块0.3-0.5cm3,尽量剪碎,加DNA抽提缓冲液400μl,在组织匀浆器中匀浆至不见组织块,转入1.5ml Ep管中,用100μl DNA抽提缓冲液冲洗匀浆器,冲洗液一并转入Ep管中。
2. 加入蛋白酶K至终浓度100-200μg/ml,混匀后放于37℃水浴5-12h,中间振摇数次。
3. 加500μl(等体积)平衡酚,颠倒混匀30s,10,000rpm离心1min,小心取出上层水相450μl,移入一新的Ep管,必要时重复抽提一次。
4. 向水相管中加入500μl氯仿,颠倒混匀30s,10,000rpm离心1min。
5. 小心取出上层水相400μl,移入另一新的Ep管,加入60μl 3M NaAc(pH4.8)和1000μl的冰无水乙醇,轻轻颠倒混匀,即可见或多或少的云絮状漂浮物。-20℃放置2h。
6. 以14,000rpm冷冻离心15min,轻轻弃去上清,用预冷的70%乙醇洗涤沉淀。
7. 待沉淀干燥后,加适量的TE或双蒸水溶解,-20℃或4℃保存备用。
8. 取5μl DNA溶液溶于495μl双蒸水中,混匀,测定其在260nm和280nm处的吸光度值。
DNA含量(mg/ml)=A260×5
(二)白细胞基因组DNA的提取
1. 收集5~10ml抗凝血,3000rpm离心10min,弃去上层淡黄色的血浆,小心吸取白细胞层。
2. 用双蒸水洗涤白细胞,使混杂的红细胞溶血,3000rpm×10min离心数次,以去除红细胞。
3. 收集白细胞沉淀,以适量双蒸水或PBS重悬白细胞,移入1.5ml的离心管中,每管0.25ml。
4. 加入等体积(0.25ml)的2×DNA抽提缓冲液,加蛋白酶K至终浓度100~200μg/ml,混匀后放于37℃水浴2~5h。
5. 加500μl(等体积)平衡酚,颠倒混匀30s,10,000rpm离心1min,小心取出上层水相450μl,移入一新的1.5ml Ep管,必要时重复抽提一次。
6. 向水相管中加入500μl氯仿,颠倒混匀30s,10,000rpm离心1min。
7. 小心取出上层水相400μl,移入另一新的Ep管,加入60μl 3M NaAc(pH4.8)和1000μl的冰无水乙醇,轻轻颠倒混匀,即可见或多或少的云絮状漂浮物。-20℃放置2h。
8. 以14,000rpm冷冻离心15min,轻轻弃去上清,用预冷的70%乙醇洗涤沉淀。
9. 待沉淀干燥后,加适量的TE或双蒸水溶解,-20℃或4℃保存备用。
10. 取5μl DNA溶液溶于495μl双蒸水中,混匀,测定其在260nm和280nm处的吸光度值。DNA含量(mg/ml)= A260×稀释倍数/20=A260×5
六、结果
0.5%的琼脂糖凝胶(加入溴化乙锭至终浓度0.5μg/ml)电泳,即可见荧光显色的DNA条带。
七、注意事项
1. 组织块取材应尽量新鲜,应在尽可能剪碎后进行匀浆。所用匀浆器须配套适中,过大过小均不利于研磨组织块。
2. 蛋白酶K应尽量新鲜配制,在正式使用前应做预试验以明确其活性。
3. 在进行平衡酚、氯仿抽提时,应尽量避免吸取蛋白质,以免影响DNA的纯度。
4. DNA沉淀不能抽得太干,否则极难溶解。稍加热可促进DNA的溶解。
组织和白细胞中基因组DNA的提取
作者:江阴雨汐生物科技有限公司 2015-06-30T00:00 (访问量:4752)
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