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解旋酶是一类能解开核苷酸双链的酶，于1976年在大肠杆菌(Esherichia Coli. E.coli.)中发现。解旋酶广泛存在于多种生物体中，尽管种类繁多，但人们在研究过程中发现，这类蛋白酶在其氨基酸序列上有一定的同源性和相似性。分析表明，这些同源序列在进化过程中构成了几个高度保守的区域，这些区域执行不同的酶功能，在细胞内它们参与DNA复制、修复、转录重组以及RNA接拼、核糖体组装、蛋白质翻译，端粒稳定。最近，发现个别解旋酶还参与机体天然免疫反应机制。

解旋酶超家族

解旋酶SF2中的RecQ解旋酶亚家族在核酸代谢过程中起了关键的作用，这一家族参与DNA复制、DNA修复、重组、转录甚至端粒稳定。人们发现在人体中存在RECQ1、BLM、WRN、RECQ4和RECQ5五种RecQ解旋酶。其中，BLM、WRN、RECQ4编码基因缺陷会导致人类相应的疾病发生，它们分别为Bloom综合症(BS)、Werner综合症(WS)、Rothmund-Thomson综合症(RTS)、RAPADIINO综合症和Baller-Gerold综合症。这些疾病在人类中都是极其罕见的隐形遗传疾病，在分子水平都表现为基因组高度不稳定性、染色体异常(染色体断裂缺失、重排、姐妹染色体交换等)和对DNA损伤因子敏感性增加。在临床上表现为过早衰老、Ⅱ型糖尿病、骨质疏松、动脉硬化和极度容易引发癌症。这一临床现象引起了人们的关注和研究。对解旋酶的结构功能、作用机制的研究不仅可以认清核酸代谢过程，还能帮助我们揭示癌症发病的某些机理。同时了解病毒解旋酶的结构与功能，为抗病毒药物的研制提供了新的研究思路。

RECQ家族结构

大部分RecQ解螺旋酶家族成员均具有一个解螺旋酶结构域，能结合并水解ATP，此外，还含有一个高度保守的多功能RecQ碳末端(RecQ C-terminal region, RQC)结构域和一个解螺旋酶RNA酶D碳末端(helicase RNase DC-terminal, HRDC)结构域。RQC结构域可使RecQ与DNA结合并介导DNA代谢的蛋白质的相互作用; HRDC结构域可促进并稳定RecQ与DNA的结合，但不具有催化活性。另外，某些RecQ家族成员还含有锌指基序，此锌指基序在维持RecQ蛋白的稳定性以及促进其与DNA结合等方面发挥重要的作用。同时DNA和蛋白质结合结构域( DNA and protein-binding domain，DPBD)可作为WRN的调控结构域，从而调控其活性，并通过蛋白质-蛋白质的相互作用促进WRN的直接细胞定位。

RecQ家族分类

WRN结构及功能

WRN由1432个氨基酸组成、分子质量为160KD。在未受损的人类细胞中，WRN 主要定位于核仁，但在 DNA 损伤后，它会迅速移动到其他核区域。S期细胞的免疫化学染色显示了 WRN 呈点状泛核分布，表明WRN可能与DNA复制有关。WRN是人类RecQ解旋酶家族中唯一拥有3， → 5，核酸外切酶活性的成员，其N末端的核酸外切酶区域，有利于WRN处理复杂的核酸结构，中间的解旋结构域，能结合并水解ATP，从而供能解开双链DNA。外切酶和解旋酶区域之间有一个具有转录活性的酸性区域。紧接着解旋酶区域，有一个高度保守的RQC结构域，在稳定结构及识别结合DNA方面发挥作用。C末端的HRDC结构域，可调节催化与DNA结合的活性。

WRN结构示意图

WRN 除了具有解旋酶和外切核酸酶活性，还与BER途径中的许多蛋白相互作用，包括 POLB、POLD、增殖细胞核抗原 (PCNA)、复制蛋白 A (RPA)、结构特异性内切核酸酶 1 (FEN-1) 和聚 (ADP-核糖) 聚合酶 1 ( PARP-1)。WRN 有利于 POLD 合成发夹结构和三核苷酸重复序列四链体结构，这对于DNA伤修复有重要作用。

WRN在BER通路中的作用机理

WRN抑制剂

Kulikowicz T等测试鉴定了四种化合物对 WRN 活性的影响, 结果显示四种化合物对 WRN 解旋酶活性的活性有不同程度的抑制，但是都不能在相同浓度范围内抑制 WRN 外切核酸酶活性。

目前已经出现的商品化抑制剂NSC 617145，是一种 WRN 解旋酶抑制剂 (IC50 = 230 nM)，以浓度依赖性方式抑制WRN解旋酶的ATP 酶活性，但不抑制外切核酸酶活性，它对 WRN 的选择性优于 BLM、FANCJ、ChlR1、RecQ 和UvrD解旋酶，在5 uM 浓度下仅表现出 7% 的RECQ1抑制。NSC 617145 通过形成 DNA 双链断裂 (DSB) 和以WRN解旋酶依赖性方式诱导细胞凋亡来抑制 HeLa 细胞的生长。NSC 617145 还与丝裂霉素 C 协同作用以抑制Fanconia 贫血缺陷细胞的生长以及诱导 DSB 和染色体异常。

结束语

爱思益普专注于基于靶点的先导化合物筛选和优化，批量构建了新药筛选的靶点和筛选技术，致力于以高效、专业的服务，帮助新药研发企业快速有效地推进新药研发项目。在WRN项目中我们构建了unwinding和ADP-Glo方法用于筛选WRN抑制剂。同时爱思益普可提供相关蛋白产品。

1.WRN unwinding方法筛选

在此方法中我们合成两条DNA单链，分别标记一个荧光基团和淬灭基团，两条单链通过退火得到dsDNA，WRN通过识别特定的序列位点，使dsDNA解旋暴露出荧光基团，产生荧光。

WRN unwinding 实验原理

2. WRN ADP-Glo方法筛选

WRN是一种依赖于ATP的解旋酶，在解旋过程中消耗ATP，生成ADP，

因此我们可使用ADP-Glo方法，通过检测产物ADP的量来判断化合物对WRN的抑制作用。

ATP-Glo 实验原理

3. 细胞学方法筛选

在酶学方法评价的同时，爱思益普可以同时进行细胞学评价，利用Operetta高内涵的平台分析DNA损伤Marker γH2AX的水平看DNA的损伤，也可以通过细胞凋亡（FACS）、增殖等手段评价化合物在MSS和MSI细胞系中的活性。

参考文献：

1. Ken Kitano, Graduate School of Biological Sciences, Nara Institute ofScience and T echnology, Japan Georgian Court College on March 18, 2015

2. Sci Rep. 2013 Nov 21;3:3294.,Sci Rep. 2013 Nov 21;3:3294.

3. Parimal Karmakar, et al. JBC Papers in Press, March 27, 2002

4. von Kobbe C, et al. JBC Papers in Press, October 8, 2003

5. Banerjee T, et al. Monika Aggarwal, Cancer Res; 73(17) September 1, 2013

6. R. Moles, et al. J Hematol Oncol. 2016; 9: 121.

7. Newman JA, et al. Life Sci Alliance. 2021 Jan; 4(1): e202000795.

8. Kocsis ZS, et al. J Biol Chem. 2014 Feb 28; 289(9): 5938–5949.

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