蛋白从头测序（De Novo Protein Sequencing）的目标是从质谱数据中无偏倚地解析蛋白质的完整氨基酸序列，包括突变、翻译后修饰（PTM）及异构体信息。要获得全面的蛋白质信息，需结合优化样品制备、先进质谱技术、多重碎裂模式、智能数据解析及翻译后修饰（PTMs）分析等策略，以确保最大程度地解析蛋白序列及其功能特性。本文将系统探讨如何通过蛋白从头测序获取全面的蛋白质信息。

一、样品制备

蛋白纯度、完整性及均一性是获取全面蛋白信息的前提。样品制备应避免降解，优化蛋白酶解策略，并去除非特异性干扰物。

1、提升蛋白纯度

（1）高丰度蛋白去除：针对含量极高的背景蛋白（如白蛋白、IgG），采用免疫亲和纯化（IP）、超速离心或凝胶过滤等方法去除，以显现低丰度目标蛋白信号。

（2）去除非蛋白杂质：样品中的盐、去污剂、核酸等杂质会影响质谱分析，通过透析或超滤等手段进行有效清除。

2、多蛋白酶联合酶解，提高序列覆盖度

（1）联合蛋白酶酶解：胰蛋白酶（Trypsin）联合其他蛋白酶（如Glu-C、Asp-N、Lys-C）消化，生成互补的肽段，提升难测序区域的覆盖。

（2）特殊蛋白酶选择：针对结构复杂或难降解蛋白，如膜蛋白，可使用无特异性蛋白酶（如蛋白酶K）配合变性剂或辅助酶解手段处理。

二、质谱分析

1、选择合适的高分辨率质谱仪

（1）高分辨率Orbitrap或FT-ICR MS（分辨率>100,000），可提供ppm级质量精度，提高氨基酸区分能力。

（2）Q-TOF MS（飞行时间质谱）结合高灵敏度与宽动态范围，适用于复杂样品解析。

2、采用多种碎裂模式

碎裂模式的优化直接影响b、y离子系列的完整性，从而影响氨基酸序列推导：

3、采用智能数据采集策略

（1）数据依赖采集（DDA）：自动选择高丰度离子碎裂，适用于高丰度蛋白。

（2）数据非依赖采集（DIA）：覆盖整个m/z范围，适用于低丰度蛋白。

（3）并行反应监测（PRM）：高精度定量特定目标蛋白，减少背景干扰。

三、数据解析

1、AI驱动的序列预测

传统算法（如PEAKS、pNovo+）依赖图谱匹配，准确度受限于质谱信号质量。基于深度学习的智能算法（如DeepNovo、AlphaPept），可提高长肽段拼接能力并修正误差。

2、氨基酸异构体区分与修正

（1）Leucine（Leu）与 Isoleucine（Ile） 等异构体的区分通过高分辨率质谱与特殊碎裂模式（如ETD）辅助解决。

（2）结合化学衍生（如H/D交换）进一步提高区分度。

3、数据整合与谱图修正

（1）采用多种蛋白酶消化获得的不同肽段信息进行比对拼接，弥补单一酶消化区域的遗漏。

（2）谱图质量提升算法、数据交叉验证，提高碎片匹配的置信度。

四、翻译后修饰（PTMs）分析

PTMs（如磷酸化、乙酰化、糖基化）是决定蛋白活性的关键信息，蛋白从头测序时必须结合特殊策略进行深入解析。

1、PTMs富集

（1）磷酸化蛋白：TiO₂ 或 IMAC磁珠富集

（2）糖基化蛋白：Lectin亲和层析或HILIC柱纯化

2、质谱分析策略

（1）HCD+EThcD 碎裂，可在保护修饰的同时解析蛋白序列。

（2）串联质谱多级（MS3）分析，提高修饰位点定位精度。

3、结合定量方法

（1）iTRAQ/TMT标记：用于PTMs定量分析，揭示动态变化。

（2）SILAC（稳定同位素标记）用于追踪修饰动态。

五、长蛋白序列拼接

1、结合Bottom-up和Top-down策略

（1）Bottom-up（蛋白降解后分析）：适用于复杂样品，但拼接难度高。

（2）Top-down（直接分析完整蛋白）：适用于蛋白突变或修饰检测，但对质谱要求高。

（3）组合策略（Middle-down），利用部分消化提高解析能力。

2、利用蛋白数据库提高拼接精度

（1）虽然从头测序本质上不依赖数据库，但结合Uniprot、NCBI等数据库进行序列比对，可用于：

（2）校对部分已知片段，提高拼接置信度

（3）识别相似蛋白，预测可能的功能修饰位点

蛋白从头测序获取全面蛋白质信息，需要从样品制备-质谱平台-数据解析-PTMs识别-序列拼接多环节协同优化，打破“单一技术依赖”，形成系统性解决方案。随着高分辨率质谱、单分子测序、人工智能等技术不断进步，蛋白从头测序将在未知蛋白探索、精准医学、抗体药物开发等领域发挥不可替代的作用，推动生命科学与生物医药产业的深度融合发展。百泰派克生物科技为广大客户提供蛋白从头测序服务。我们的“一站式”服务能为您节省时间和精力，帮助您更高效地开展相关研究。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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